Introducción:

Las guías internacionales recomiendan estudio de resistencia antirretroviral por  genotipificación en pacientes embarazadas VIH positivas para la adecuación del tratamiento antirretroviral (ARV) y la prevención de la transmisión vertical madre-hijo. Actualmente, el gold estándar para la genotipificación del VIH es la secuenciación Sanger (SS), un método costoso, muy laborioso, tiempo demandante y con una sensibilidad en la detección de mutaciones de resistencia cercana al 20%. La secuenciación de última generación (NGS) se ha posicionado como una alternativa superadora a la SS debido a su alta sensibilidad y su mayor capacidad productiva. La fiabilidad de esta nueva metodología aplicada a la genotipificación del VIH permitiría diseñar con facilidad estudios de grandes poblaciones de pacientes (ej. para farmacovigilancia de VIH) con un costo similar a la SS pero en un menor tiempo, con el valor agregado que implicaría la identificación de mutaciones de resistencia con una sensibilidad mayor que la presentada por la actual metodología.

Objetivo:

Estandarizar y evaluar el uso de secuenciación de última generación en la genotipificación para resistencia antirretroviral a partir del estudio de pacientes embarazadas naive VIH positivas previamente estudiadas por Secuenciación Sanger. Materiales y métodos: Se secuenciaron 42 muestras de plasma con EDTA provenientes de pacientes embarazadas naive, estudiadas por SS. Se utilizó el protocolo provisto por la Organización Panamericana de la Salud en conjunto con la Agencia de Salud de Canadá (PHAC). El mismo consta de una extracción de ARN viral a partir de 400 ul de plasma con EDTA, one-step RT/PCR seguida de una segunda ronda de PCR, con enzimas de alta fidelidad y primers específicos para un amplio espectro de virus VIH. Posteriormente, los amplicones obtenidos de las 42  muestras fueron procesados en una misma corrida de secuenciación utilizando un secuenciador MiSeq Illumina y la química Nextera XT V2. Se identificaron las mutaciones de resistencia de cada muestra mediante el análisis bioinformático del archivo FASTQ obtenido por NGS. Se utilizó el software HYDRA, provisto por la PHAC, donde se eligió como secuencia de referencia HXB2 (GenBank accession number K03455) y filtro de 20% de sensibilidad. Por último, las mutaciones de resistencia identificadas en cada una de las 42 muestras se compararon con los resultados previamente obtenidos por SS. Resultados: Se obtuvo un 100% de concordancia entre los resultados producidos por NGS y los previamente obtenidos SS con un filtro de 20% de sensibilidad.

Conclusión:

La concordancia entre ambas metodologías demuestra que la secuenciación de última generación y el protocolo provisto por OPS podrían ser utilizados como una alternativa confiable a la secuenciación Sanger en la genotipificación del VIH para resistencia antirretroviral en esta población de pacientes naive. Se encuentra en proceso de análisis de los datos obtenidos la aplicación de filtros de mayor sensibilidad, para evaluar la detección de variantes presentes por debajo del 20% y su impacto en el desarrollo de resistencia en las pacientes del presente estudio.