Introducción:

El complejo A. baumannii (Aba) se considera uno de los principales patógenos causante de infecciones asociadas al cuidado de la salud, con alto nivel de resistencia a la mayoría de los antimicrobianos y escasas opciones de tratamiento. En Argentina, la resistencia a carbapenemes en Aba supera el 85% desde el 2010, fundamentalmente por adquisición o hiperproducción de carbapenemasas (CBP) de clase D típicas de este género. En 2014 emergen en nuestro medio los primeros aislamientos de Aba portadores de metalo-ß-lactamasa tipo NDM.

Objetivos:

Diseñar una PCR múltiple de tiempo final para detectar en simultáneo blaOXA-23, blaOXA-58 y blaNDM, las CBP adquiridas más frecuentes en Acinetobacter spp. (ACI), y blaOXA-51, la betalactamasa propia de especie de Aba.

Materiales y Métodos:

Se utilizaron 98 aislamientos clínicos de ACI resistentes a carbapenemes: 82 Aba, 3 A. bereziniae, 3 A. junii, 2 A. nosocomialis, 2 A. pittii, 2 A. haemolyticus, 1 A. indicus, 1 A. johnsonii, 1 A. lwoffi y 1 A. ursingii, procedentes del repositorio de nuestro laboratorio, previamente caracterizados por PCR convencional para blaOXA-23 (n=65), blaOXA-58 (n=16), blaNDM (n=22), blaOXA-51 (n=82), blaIMP (n=1) y/o WGS, e identificados por MALDI-TOF MS. El extracto de ADN se obtuvo por calentamiento (10 min. a 100ºC) de una suspensión de colonias en agua bidestilada y posterior centrifugación a 12000 G por 5 min. Los cebadores utilizados fueron: O23x-F (5´-ACGCCTATTCAAGAGGTAGAG), O23x-R (5´-GTATAGATGCCGGCATTTCTGA), O58-F (5´-AAGTATTGGGGCTTGTGCTG), O58-R (5´-TACGACGTGCCAATTCTTGA), NDM-F (5´-AGCACACTTCCTATCTCGAC), NDM-R (5´-GGCGTAGTGCTCAGTGTC), O51x-F (5´-GAGGCACAGTTTGCTTACAAGC), O51x-R (5´-GCTGAACAACCCATCCAGTT). La reacción de amplificación se realizó en un volumen final de 25 µl, en diferentes condiciones, modificando la temperatura de pegado y concentraciones de cebadores. Los productos de PCR se sembraron en un gel de agarosa 1% con bromuro de etidio. Los productos de PCR se secuenciaron por el método de Sanger.

Resultados:

Las condiciones óptimas para la reacción fueron: 50 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl (pH: 8,4), 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,04 U/µl Taq-DNA polimerasa, 0,2 µM de cada cebador. Se utilizaron 2,5 µl del extracto de ADN como templado. Condiciones de ciclado: 5´ a 95ºC, 35 ciclos de 30´´ a 95ºC, 30´´ a 52ºC y 30´´ a 72ºC, con un paso final de 10´ a 72ºC. En 97 aislamientos se obtuvo amplificación que correspondió con los tamaños esperados (65/65 blaOXA-23, 16/16 blaOXA-58, 22/22 blaNDM, 82/82 blaOXA-51). Un aislamiento de A. bereziniae portador de blaIMP resultó negativo. Se obtuvo 100% de sensibilidad y especificidad.

Discusión / Conclusiones:

La PCR múltiple permitió detectar en simultáneo blaOXA-23, blaOXA-58, blaNDM y blaOXA-51 en aislamientos clínicos de ACI. Esta PCR múltiple permitirá a los laboratorios clínicos la caracterización de las CBP prevalentes en ACI de Argentina, lo que contribuirá al conocimiento de la epidemiología local y al diseño de medidas de prevención y control de las infecciones.