Introducción:
Los eumicetomas son infecciones fúngicas crónicas caracterizadas por la presencia de masas subcutáneas y fistulas por las que drenan granos de distintos colores. Los agentes de eumicetomas de grano negro pertenecen a dos órdenes fúngicos llamados Sodariales y Pleosporales. Los agentes de eumicetomas de grano negro más comúnmente aislados a nivel mundial son Madurella mycetomatis (Sordarial), Trematosphaeria grisea (antes llamada Madurella grisea) y Nigrograna mackinonii (ambos Pleosporales). La sensibilidad de estos hongos a los antifúngicos es desconocida y difícil de evaluar utilizando los métodos disponibles en el laboratorio clínico ya que no generan elementos de fructificación. Además, las secuencias de los genes blanco de antifúngicos de estos hongos no se conocen. Esto impide establecer relaciones feno/genotípicas que permitan inferir su sensibilidad.
Objetivos:
Clonar y caracterizar el gen blanco de las equinocandinas de Madurella mycetomatis (llamado FKS1). Estudiar sus secuencias y establecer la relación genotipo/fenotipo de la sensibilidad a las equinocandinas utilizando una cepa quimérica de Saccharomyces cerevisiae que se transformó con un gen FKS1 híbrido que incluye la región hot spot 1 de M. mycetomatis.
Material y métodos:
Se obtuvo DNA de una cepa control de Madurella mycetomatis (CBS) por el método fenol cloroformo. Se amplificó una porción del gen FKS1 utilizando primers degenerados. Se clonó el fragmento en plásmidos comerciales (P-GemT easy vector) y se secuenció utilizando primers universales. Esta secuencia fue utilizada para generar un FKS1 quimérico que presentaba los extremos 5´ y 3´ de Saccharomyces cerevisiae y la región hot spot 1 de Madurella mycetomatis. Esta construcción se transformó utilizando acetato de litio en una cepa de Saccharomyces cerevisiae de nuestro laboratorio (Saccharomyces cerevisiae BY4742) que presenta el gen FKS1 delecionado con el cassette URA3. Esta cepa es hipersensible a equincandinas y sensible a FK506. Los transformantes fueron seleccionados con FK506 ya que la presencia de un gen FKS1 activo, convierte a las cepas fúngicas en resistentes a esta droga. La sensibilidad a caspofungina y anidulafungina fue evaluada en las cepas transformantes y parentales de Saccharomyces cerevisiae utilizando el protocolo M27 4ta edición de CLSI.
Resultados:
La secuencia hot spot 1 de Madurella mycetomatis fue traducida como YLTLSIRDP. Esta secuencia de aminoácidos presentó diferencias con las secuencias de especies sensibles a las equinocandinas por ej. Candida albicans (FLTLSLRDP). La cepa transformante quimérica de Saccharomyces cerevisiae mostró un aumento de 32 veces la CIM a caspofungina y anidulafungina cuando se la comparó con la cepa parental Saccharomyces cerevisiae BY4742 (0,50 µg/ml y 0.015 µg/ml, respectivamente).
Conclusiones:
Podemos concluir que el hot spot 1 de Fks1p Madurella mycetomatis es suficiente y necesario para explicar la reducción en la sensibilidad a las equinocandinas observada en la cepa quimérica obtenida. El cambio en el primer aminoácido del hot spot 1 (tirosina por fenilalanina) fue implicado en resistencias primarias y secundarias a las equinocandinas en especies fúngicas diversas, que van desde levaduras del género Candida hasta hongos filamentosos como Fusarium spp., Scedosporium spp. y Aspergillus fumigatus. A pesar de que no hemos encontrado datos sobre tratamientos de micetomas con equinocandinas, nuestros resultados anticiparían la ineficacia de estas drogas frente a Madurella mycetomatis.
