Introducción:
La criptococosis es una importante causa de mortalidad asociada al SIDA. El principal agente etiológico es Cryptococcus neoformans. El tratamiento de estas micosis incluye anfotericina B (AMB), 5-fluorcitocina y fluconazol (FLC). La prevalencia de resistencia a FLC es elevada. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes no han sido suficientemente estudiados. Solo se han descripto cuatro mecanismos de resistencia a azoles en C. neoformans que incluyen dos mutaciones (Y145F y G484S) que alteran la afinidad de las drogas por la 14 alfa esterol demetilasa o ERG11 (blanco de los azoles), alteraciones en otros genes de la vía de síntesis del ergosterol y heterorresistencia por duplicaciones genómicas reversibles.
Objetivo:
Estudiar el mecanismo de resistencia a FLC en un grupo de cepas de C. neoformans aisladas de un paciente que no respondió al tratamiento con este azol.
Material y métodos:
Se estudiaron cepas aisladas a partir de líquido cefalorraquídeo y sangre de un paciente HIV positivo en tratamiento prolongado con FLC. Las cepas fueron aisladas durante el primer (cepas LMDM-908A y LMDM-908B) y segundo episodio (LMDM-909) de meningitis sucedidos con 11 meses de diferencia y donde el paciente recibió FLC como tratamiento de manera continua. Las cepas fueron identificadas fenotípica y genéticamente como C. neoformans (antes: C. neoformans var. grubii). La clonalidad entre las cepas se estudió utilizando la técnica de Multilocus Sequencing Typing (MLST) siguiendo el protocolo de Fungal MLST Database. La sensibilidad a FLC, AMB, voriconazol (VRC), posaconazol (PSC) e itraconazol (ITC) se determinó siguiendo el protocolo de CLSI documentos M27A3 y M27S4. Se amplificaron los genes ERG11 de las cepas incluyendo promotores, marcos abiertos de lectura y terminadores (3000 nt) con primers diseñados específicamente para este fin. Las secuencias de los 6 genes de MLST y del ERG11 fueron analizadas por Clustal W con BioEdit.
Resultados:
Las cepas LMDM-908A, LMDM-908B y LMDM-909 tuvieron el mismo genotipo (SOD1: alelo 1, CAP59: alelo 7, LAC1: alelo 3, IGS1: alelo 1, PLB1: alelo 3, GPD1: alelo 1) y por lo tanto son clonales. Los C. neoformans LMDM-908A y LMDM-908B, fueron sensibles a todos los antifúngicos (FLC: 1,0 µg/ml, VRC: 0,12 µg/ml, PSC: 0,12 µg/ml, ITC 0,12 µg/ml y AMB: 0,5 µg/ml). En tanto que la cepa LMDM-909 fue resistente a FLC (8 µg/ml) y presentó los mismos valores de CIM para los otros antifúngicos. La secuenciación del gen ERG11 demostró que la cepa LMDM-909 presentó la mutación C960T (en heterocigosis) que produce el cambio de aminoácido P253L.
Conclusiones:
La clonalidad de las cepas indica que la mutación C960T en heterocigosis en el gen ERG11 (cambio de aa. P253P/L) es la responsable del fenotipo de resistencia a FLC en la cepa LMDM-909. El cambio de aminoácido se produjo en una región conservada en las 14 alfa esterol demetilasas fúngicas sindicada como una región que contacta directamente con los azoles. En esta región se han descrito mutaciones en Aspergillus fumigatus y Candida albicans relacionadas con resistencia a azoles pero nunca antes se la había descrito en C. neoformans.
