Introducción:
El aumento de la prevalencia de patógenos extremadamente resistentes a los antimicrobianos, y en particular los aislamientos de Enterobacterales productores de carbapenemasas (CBPs) es un desafío para los sistemas de salud. Una consecuencia tecnológica de la pandemia por COVID-19 es la adquisición de equipamiento de PCR en tiempo real (qPCR) por las instituciones de salud, el cual puede ser utilizado para la detección e identificación temprana de CBP.
Objetivos:
Poner a punto un sistema de detección e identificación de las principales CBP de Enterobacterales analizando las curvas de mealting de los productos de amplificación obtenidos por qPCR multiplex.
Materiales y Métodos:
Para las reacciones de qPCR se utilizó la mezcla MeltDoctor®HRM (Applied Biosystems) en un volumen final de 20uL. Se utilizaron los primers (concentración) de Monteiro J. et. al. 2012. (doi:10.1093/jac/dkr563) para amplificar blaKPC (0,2mM), blaNDM (0,4mM) y blaOXA-48-like (0,2mM). Se diseñaron los primers para blaVIM (0,2mM), VIM-RT-F AGTGGTGAGTATCCGACAG; VIM-RT-R ATGAAAGTGCGTGGAGAC; y blaIMP (0,6mM) IMP-RT-F GAGTGGCTTAATTCTCRATC; IMP-RT-R GGYARCCAAACCACTASGTTATCT. Se utilizó el equipo AriaMX System (Agilent), la curva de mealting se realizó con una resolución de 0,2°C/5 segundos. Se utilizaron 38 Enterobacterales con las variantes de CBP más frecuentes en nuestro país. Los aislamientos presentaban entre 1 y 3 genes de CBPs. La extracción de ADN se realizó por la técnica de boiling.
Resultados:
Los 38 aislamientos rindieron amplificación positiva entre los ciclos 12,68 y 24,1. Se definió un Ct máximo de 25 ciclos para considerar amplificación positiva. Para cada gen se obtuvo un rango de temperatura de mealting (T°m) acotado, salvo para KPC que tuvo el rango más amplio de 1,32°C (Tabla). No se solaparon los rangos de T°m definido para cada gen. La presencia de múltiples CBPs pudieron ser correctamente identificadas.
Discusión / Conclusiones:
El sistema basado en el análisis de productos de qPCR aquí presentado permitió la correcta detección e identificación de las variantes de CBP más comunes de Enterobacterales de nuestro país. La detección de variantes inusuales puede dar perfiles de T°m por fuera de los rangos obtenidos, por lo que deberían ser contrastados por otra técnica o derivados a un laboratorio de referencia. La correlación entre la fenotipia y la detección molecular debería ser monitoreada. La identificación temprana del tipo de CBP en infecciones severas tiene un impacto directo sobre la optimización del tratamiento.
