INTRODUCCIÓN:

El laboratorio de Microbiología Clínica utiliza técnicas fenotípicas para la identificación de agentes etiológicos en infecciones bacterianas, sin embargo, en numerosas situaciones no revelan los microorganismo causales.
El uso de técnicas moleculares como PCR-secuenciación del ADNr 16S permitió solventar tales limitaciones, siendo de gran utilidad en la detección de bacterias fastidiosas y/o pacientes expuestos a tratamiento antibiótico.

OBJETIVOS:

• Puesta a punto de un método genotípico basado en la amplificación del gen que codifica para el ARNr 16S a partir de muestras clínicas.
• Establecer si existe ventaja comparativa del método molecular con respecto a la identificación realizada por los métodos fenotípicos

MATERIALES Y METODOS:

Se analizaron 56 muestras, 14 Líquidos cefalorraquídeo (LCR), 9 líquidos de punción (LP), 17 biopsias (BX), 8 válvulas cardiacas (VC) y 8 controles de calidad externos (CCE), mediante cultivo convencional y el siguente protocolo de PCR:
• Extracción de ADN de las muestras pre-tratadas con lisozima y proteinasa K, por el método automatizado Magna Pure (Roche).
• Amplificación de un fragmento 5´del ADNr 16S.
• Secuenciacion por metodología Sanger en un ABI3500.
• Identificación utilizando las bases de datos GeneBank y RDP-II

RESULTADOS:

Se obtuvo concordancia positiva en 21 muestras (5 BX, 1 LCR ,8 LP y 7 CCE), identificándose Staphylococcus aureus (6), Staphylococcus epidermidis (4), Pseudomona aeuriginosa, Acinetobacter sp., Enterococcus sp., Providencia stuartii, Moraxella lacunata, Vibrio cholerae, Serratia marcesens. 4 muestras presentaron secuencias mixtas y por cultivo más de un aislamiento bacteriano. En 26 muestras (13 LCR, 9 BX y 4 VC) la concordancia fue negativa.
En 4 muestras (3 BX y 1LP) se obtuvo resultado negativo para PCR y positivo para cultivo luego de siete días de incubación en medio de enriquecimiento, tres casos fueron Staphylococcus epidermidis y uno Corynebacterium sp. Se consideró posible contaminación excluyéndose de los cálculos analíticos.
Se obtuvo resultado positivo para PCR y negativo por métodos fenotípicos en 5 muestras (4 VC y 1 CCE). Se identificaron Coxiella burnetti, Campylobacter jejuni, Corynebacterium pseudodiphithericum y Streptococcus agalactiae(2).
Se calculó la sensibilidad (S) y especificidad (E) de la PCR frente al cultivo: S=100%, E=83,9%,valor predictivo positivo (VPP) del 80,8% y valor predictivo negativo (VPN) del 100%.

CONCLUSION:

La metodología desarrollada constituye un aporte al diagnóstico de infecciones bacterianas, otorgando ventajas tanto en su VPP como VPN.
Los resultados positivos para PCR y negativos para cultivo se correlacionaron con el diagnóstico clínico, indicando mayor sensibilidad en la detección bacteriana, demostrando su valor diagnóstico en casos de microorganismos no cultivables y/o expuestos a tratamiento antibiótico. Los resultados negativos de PCR con cultivo positivo tardío mostró la utilidad de esta metodología para descartar contaminaciones.
Cabe recalcar la reducción en el tiempo de los resultados frente a los cultivos convencionales, siendo de gran de utilidad en la toma de decisión clínica frente a una posible infección bacteriana.